武汉大学蔡强课题组研究揭示真菌细胞外囊泡介导毒力效应因子跨界运输侵染植物的作用机制

近日，武汉大学生命科学学院杂交水稻全国重点实验室蔡强教授课题组在Cell Press细胞出版社旗下期刊Molecular Plant发表题为“Fungal extracellular vesicles mediate cross-kingdom trafficking of virulence effectors into plant cells to promote infection”的研究论文。该研究发现，病原真菌能够将其毒力相关的效应蛋白包裹在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）内，并利用宿主植物细胞的网格蛋白介导的内吞途径（Clathrin-Mediated Endocytosis, CME）进入植物细胞。通过这一机制，EVs递送的效应蛋白直接靶向并操纵植物叶绿体免疫通路（如ROS信号），从而促进侵染。该研究为开发基于干扰EV功能或效应蛋白活性的新型病害绿色防控靶点提供了重要理论基础。

研究背景

EVs是真核生物中高度保守的跨细胞通讯载体。其磷脂双分子层能有效保护内部包裹的核酸、蛋白质、脂质等生物活性分子免遭降解。在植物-微生物互作研究中，EVs已被证实是跨界信号传递的关键媒介：植物源EVs可递送小RNA以沉默真菌毒力基因；反之，真菌源EVs也可转运小RNA促进其对植物的侵染；尤为值得注意的是，植物mRNA甚至可通过EVs被转运至真菌细胞中进行翻译，从而抑制侵染。值得注意的是，该课题组今年已发表的研究表明，水稻防御蛋白特异性富集于EVs中，并被递送至植物病原真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的细胞内，以抑制其生长和侵染（Developmental Cell, 2025 doi: 10.1016/j.devcel.2024.12.020.）。这一发现凸显了EV蛋白组分的重要性。然而，真菌EVs的蛋白质组成及其在宿主免疫中的功能机制仍有待深入解析。目前，真菌EVs的研究主要集中于致病酵母与动物细胞的相互作用，对丝状真菌EVs的研究相对匮乏。特别是在植物病原真菌领域，植物病原真菌EVs所携带的蛋白质如何调控植物-病原体互作过程，其分子机制在很大程度上仍属未知。

研究内容

1.效应蛋白的致病功能验证：建立了R. solani EVs的分离纯化体系，鉴定出EV富集的效应蛋白RsNP8和RsSerp。多项实验证明RsNP8和RsSerp通过真菌EVs向细胞外分泌。利用HIGS技术构建靶向RsNP8和RsSerp的RNAi植株，接种实验显示其抗病性显著高于野生型；而过表达株系则表现出更强的感病性。在灰霉菌中异源表达RsNP8和RsSerp增强了真菌EVs的致病性。以上实验证实RsNP8和RsSerp是R. solani的关键毒力因子。

2.EVs通过CME途径进入植物细胞：R. solani侵染诱导植物内吞的形成，并且网格蛋白包被囊泡（CCVs）在入侵点附近大量聚集。CME特异抑制剂（ES9-17）处理或CME缺陷突变体（chc2-1、ap2σ）均表现为对R. solani抗病性显著升高。通过抗体特异性从R. solani侵染植株中IP了CCVs，并通过Western blot检测到了真菌EV标记蛋白RsTsp2及效应蛋白RsNP8和RsSerp，证实携带RsNP8和RsSerp的真菌EVs依赖宿主CME途径被植物摄取。

3.效应蛋白RsNP8靶向植物叶绿体蛋白NICP1：通过多项体内体外蛋白互作实验证明RsNP8特异性结合植物的叶绿体蛋白NICP1。nicp1突变体对R. solani更敏感，且多个免疫基因表达下降。在几丁质激发下，nicp1突变体的ROS积累能力较野生型和回补株系显著减弱。表明NICP1增强 ROS 生成并促进植物免疫。

4.效应蛋白RsNP8靶向NICP1抑制ROS积累，促进感病：在几丁质激发下，过表达RsNP8的植物表现出ROS爆发显著减弱。而共表达实验证实RsNP8能拮抗NICP1介导的叶绿体ROS产生。在nicp1突变体中过表达或沉默RsNP8的遗传学分析表明，RsNP8抑制植物ROS爆发以及促进植物感病的功能依赖于宿主叶绿体蛋白NICP1。

5. RNAi介导的抗病性在水稻中的应用：水稻OsNICP1在叶绿体定位，且和RsNP8互作，说明R. solani致病机制在水稻中保守存在。利用SIGS和HIGS等RNAi技术在水稻中同时抑制真菌EV标记蛋白（RsTsp2，介导EV形成）和毒力效应蛋白（RsSerp，RsNP8）的表达，能有效延缓纹枯病的发展进程。

研究结论和意义

这项研究揭示了R. solani通过分泌EVs，将其关键的毒力效应蛋白（如RsNP8，RsSerp）运送到宿主植物细胞中。这一入侵过程利用了植物自身的内吞途径（CME）。进入细胞后，效应蛋白RsNP8靶向并抑制叶绿体蛋白NICP1的功能，从而干扰植物ROS免疫信号通路，最终帮助病菌成功侵染。

本研究在真菌EVs生物学功能与致病机制研究领域取得重要突破：一方面，揭示了真菌EVs作为毒力效应蛋白跨界转运载体的新功能，拓展了EVs在生物跨界互作中的功能认知；另一方面，阐明了“EVs分泌效应蛋白-宿主CME途径内化-免疫通路靶向抑制”的全新致病机制，系统解析了真菌效应蛋白从分泌、转运到发挥毒力功能的完整分子路径。这些发现构建了病原-宿主互作的理论新框架，为发展基于EVs防控植物病害新策略提供了重要的依据。